實(shí)驗(yàn)方案分享：針對(duì)猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的定性實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）檢測(cè)

欄目：技術(shù)分享發(fā)布時(shí)間：2024-07-01

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix 實(shí)驗(yàn)方案 1

針對(duì)猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的定性實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）檢測(cè)：

1. 研究背景與目的

- 猴痘病毒（MPXV）是正痘病毒屬（Orthopoxvirus, OPXV）的一種，自天花根除以來，已成為由OPXV引起的最嚴(yán)重疾病。

- 2022年全球猴痘疫情的爆發(fā)促使需要增加臨床測(cè)試的診斷能力。

- 研究目的是驗(yàn)證一種定性的OPXV實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，并描述其在臨床實(shí)驗(yàn)室診斷MPXV的分析性能。

2. 材料與方法

2.1 分析性能實(shí)驗(yàn)材料

- 使用含有合成MPXV DNA的通用轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)（UTM）或病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)（VTM）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 DNA提取

- 使用核酸提取儀器進(jìn)行自動(dòng)化核酸提取。

2.3 實(shí)時(shí)TaqMan PCR檢測(cè)

- 總反應(yīng)體積：20 μL（包含5 μL的模板和15 μL的主混合液）。

- 主混合液成分：

- 5 μL DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix （GDSBio, V5005）。

- 7 μL dH2O。

- 1 μL 正向引物（10 nm）。

- 1 μL 反向引物（10 nm）。

- 1 μL 探針（5 nm），針對(duì)OPXV目標(biāo)序列。

- 臨床樣本測(cè)試：當(dāng)加入內(nèi)控時(shí)，dH2O的體積減少至4 μL，以允許加入1 μL的正向和反向引物（各10 nm）和探針（5 nm），針對(duì)人類RNAseP基因。

- 實(shí)時(shí)PCR操作：使用Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems），并按照以下循環(huán)條件進(jìn)行：

- 1個(gè)循環(huán)：95.0°C持續(xù)2分鐘。

- 40個(gè)循環(huán)：95.0°C持續(xù)3秒，60.0°C持續(xù)31秒。

在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)PCR是用來檢測(cè)和定量猴痘病毒DNA的。使用的TaqMan化學(xué)方法是一種常用的熒光定量PCR技術(shù)，它可以在PCR擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的累積量。通過這種方式，可以準(zhǔn)確測(cè)定病毒DNA的濃度，從而幫助診斷猴痘病毒感染。

以下是實(shí)驗(yàn)中使用的引物和探針序列：

1. OPXV目標(biāo)的引物和探針序列：

- 正向引物(F): `TCAACTGAAAAGGCCATCTATGA`

- 反向引物(R): `GAGTATAGAGCACTATTTCTAAATCCCA`

- 探針(P): `FAM-CCATGCAATATACGTACAAGATAGTAGCCAAC`

2. 人類RNAseP基因作為內(nèi)控的引物和探針序列：

- 正向引物(F): `AGATTTGGACCTGCGAGCG`

- 反向引物(R): `GAGCGGCTGTCTCCACAAGT`

- 探針(P): `Cy5–TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG`

3. 首月測(cè)試中得到的陽性患者樣本也在內(nèi)部使用基于研究的猴痘特異性PCR進(jìn)行了檢測(cè)，使用的引物和探針序列（針對(duì)B6R基因）：

- 正向引物(F): `ATTGGTCATTATTTTTGTCACAGGAACA`

- 反向引物(R): `AATGGCGTTGACAATTATGGGTG`

- 探針(P): `FAM-AGAGATTAGAAATA`

2.4 檢測(cè)限（LOD）

- 通過將MPXV DNA稀釋至不同濃度并檢測(cè)，確定LOD。

2.5 可重復(fù)性

- 使用100個(gè)拷貝/mL的MPXV陽性樣本和陰性UTM/VTM評(píng)估可重復(fù)性。

2.6 特異性

- 測(cè)試已知陽性患者樣本，包括單純皰疹病毒1型、2型等，以確定特異性。

2.7 一致性

- 使用88個(gè)盲樣（包括陰性和不同濃度的陽性樣本）進(jìn)行測(cè)試。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)方案詳細(xì)地描述了從樣本收集、核酸提取、實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)到結(jié)果分析的全過程。

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix

貨號(hào)：V5005，V5006

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix是用于一步法多重?zé)晒舛?/span>PCR的試劑。它以探針和特異性引物來定量檢測(cè)RNA或DNA靶標(biāo)序列。優(yōu)化的緩沖液組分可以協(xié)助在一個(gè)體系內(nèi)完成多達(dá)4個(gè)RNA或DNA序列的多重定量PCR。該混合液以4倍濃度提供，能夠加入更多的模板進(jìn)行反應(yīng)，從而提高檢測(cè)的靈敏度。