Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 實驗方案 1

多克隆瘧原蟲株系中特定單倍型藥物反應表型的剖析：

1. 實驗材料和試劑準備

- 選擇3個疑似多克隆的P. falciparum株系，例如：IPC_3445 (MRA-1236), IPC_5202 (MRA-1240), IPC_6403 (MRA-1285)。

- 準備O+型人類紅細胞和RPMI 1640培養基，以及所需的補充劑和抗生素。

- 準備氯喹、甲氟喹和哌拉喹藥物儲備溶液。

- 準備用于DNA提取、基因分型和PCR反應的相關試劑。

2. 瘧原蟲株系的體外培養

- 使用標準體外培養條件，將瘧原蟲株系在37°C、5% CO2和90% N2氣氛下培養。

3. 多克隆性質的確認

- 提取每個瘧原蟲株系的DNA，并在24個高度多態性SNP位點進行基因分型。

4. 單一寄生蟲譜系的分離

- 通過限制稀釋法，將瘧原蟲株系在96孔板中進行稀釋，以分離單個受感染的紅細胞。

- 使用SYBR? Green I熒光染料檢測寄生蟲DNA，確定陽性孔。

5. 基因分型和系統發育分析

- 對每個陽性孔中的寄生蟲進行基因分型，使用24-SNP分子條形碼法。

- 構建系統發育樹，分析不同寄生蟲譜系之間的關系。

6. 體外抗瘧藥敏感性測試

- 使用SYBR? Green Antimalarial Assay對氯喹、甲氟喹和哌拉喹的敏感性進行測試。

- 測定每種藥物的半最大抑制濃度（IC50）。

7. 寄生蟲存活試驗

- 對于CQ和PPQ，使用環階段存活試驗(RSA)和哌拉喹存活試驗(PSA)來確定寄生蟲對藥物的存活率。

8. 抗瘧藥抗性位點的測序和基因分型

8.1 目標基因的選擇

選擇已知與抗瘧藥抗性相關的基因，包括但不限于：

- 氯喹抗性相關基因：pfcrt（瘧原蟲氯喹抗性轉運蛋白）

- 甲氟喹和哌拉喹抗性相關基因：pfmdr-1（瘧原蟲多藥耐藥1基因）

- 蒿甲醚抗性相關基因：K13基因

8.2 DNA提取和PCR擴增

- 使用DNA提取試劑盒從瘧原蟲培養物中提取基因組DNA。

- 設計特異性引物，針對上述基因進行PCR擴增。例如，使用五組引物覆蓋整個pfcrt基因。

8.3 SNPs檢測

- 使用Sanger測序技術對PCR產物進行測序，以檢測pfcrt、pfmdr-1和K13基因中的單核苷酸多態性（SNPs）。

- 利用測序結果分析軟件（如DNASTAR Lasergene）進行序列數據的分析和可視化。

8.4 拷貝數變異檢測

- 使用ΔΔCT方法確定pfmdr-1和pfmp-2（瘧原蟲血漿膜蛋白2基因）的拷貝數，這些基因與甲氟喹和哌拉喹抗性相關。

- 通過實時定量PCR（qPCR）技術，在同一孔中同時擴增目標基因和內參基因（如β-微管蛋白基因或絲氨酸tRNA連接酶基因）。

8.5 qPCR實驗操作

- 準備主混合液，包含Multiplex Probe qPCR Mix Plus U （GDSBio, P2701）、無菌水、目標基因和內參基因的預配方Taqman SNP檢測。

- 將主混合液分配到96孔PCR板中，每個樣本包含75 ng的寄生蟲DNA。

- 使用CFX96實時PCR儀器進行樣品擴增，并使用基因表達模塊分析結果。

8.6 數據分析

- 將目標基因的拷貝數與內參基因的拷貝數進行比較，以確定相對拷貝數。

- 使用已知拷貝數的標準樣品（如3D7株系）進行校準。

- 對于pfmdr-1和pfmp-2基因，分析是否存在基因擴增現象，這可能與抗藥性發展有關。

8.7 結果記錄和解釋

- 記錄所有測序和qPCR結果，包括基因型和拷貝數。

- 解釋測序和拷貝數變異數據，分析它們與體外抗藥性表型之間的潛在聯系。

8.8 質量控制

- 包括使用已知基因型的實驗室控制株系作為陽性和陰性對照。

- 對每個實驗步驟進行重復，以確保數據的準確性和可重復性。

以上步驟提供了詳細的實驗流程，用于檢測和分析與抗瘧藥抗性相關的基因變異。實驗操作應嚴格遵守實驗室規程和生物安全指南，確保數據的準確性和可靠性。

9. 數據分析

- 使用GraphPad Prism軟件分析IC50值和存活率數據。

- 應用統計方法比較不同寄生蟲譜系之間的差異。

10. 結果解釋和報告

- 解釋實驗結果，討論不同寄生蟲譜系的抗藥性表型。

- 撰寫實驗報告，包括實驗方法、結果和討論。

11. 安全性和質量控制

- 確保實驗操作符合生物安全標準。

- 使用已知的實驗室控制株系作為陽性和陰性對照。

12. 實驗材料的保存和記錄

- 記錄所有實驗步驟和結果。

- 保存所有原始數據和實驗材料，以備后續分析和驗證。

這個實驗方案提供了一個全面的框架，用于研究P. falciparum株系的多克隆性和抗藥性表型。實驗操作應嚴格遵守實驗室規程和生物安全指南。

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 

貨號：P2701，P2702，P2703，P2704 

產品簡介 

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 是用于探針法實時定量 PCR 的 2×濃縮預混液，使用時 只需加入模板、引物和探針即可進行反應。本品含有抗體技術修飾的熱啟動酶 Hotstart Taq DNA 聚合酶，配合東盛特制的 Real Time PCR Buffer，不僅有效抑制引物二聚體和其他非 特異性擴增，而且能夠提高擴增效率，可以進行多重探針 qPCR 反應。該試劑引入 了 dUTP/UDG 防污染系統，可以在 PCR 反應前清除含 dUTP 的 PCR 產物，有效避免因 擴增產物的交叉污染對定量的影響。本品方便用于制備 IVD 分子診斷試劑盒，對靶基因定 量準確、可信度高，重復性好。本品可搭配 TaqMan 等各類熒光探針使用，與常見定量 PCR 儀完美兼容，如 ABI、Roche、Bio-Rad 等。 

產品用途

探針法基因表達分析

多重低拷貝基因檢測

產品特點

可進行多重探針法熒光定量PCR

適合常見定量機型

高效熱啟動技術帶來高特異和可重復的擴增

含 dUTP/UDG 防污染系統

穩定性高，適合大規模檢測