Pfu DNA Polymerase

Cat. #：P1021，P1022，P1023，P1024

產(chǎn)品簡介

Pfu DNA Polymerase是極端嗜熱性細(xì)菌Pyrococcus furiosus來源的高度熱穩(wěn)定DNA聚合酶，分子量為90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。擴(kuò)增片段的長度可達(dá)5 kb（簡單模板）。延伸速度為2min/kb（70~75℃，簡單模板可達(dá)20s/kb）。該酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，擴(kuò)增產(chǎn)物具有平末端。

產(chǎn)品組成

[1] 10× Pfu Buffer分為Mg²⁺ Plus與Mg²⁺ Free兩種包裝，可方便選擇。如無特別說明提供10× Pfu Buffer(Mg²⁺ Plus)。Mg²⁺ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl₂。

[2] 6× Loading Buffer，如有需要可單獨(dú)購買（Cat. #：M9041）。

[3] dNTPs是dATP、dGTP、dCTP和dTTP等摩爾混合物，P1021/P1023不含dNTPs，如有需要請單獨(dú)購買（Cat. #：P9011/P9012/P9013）。

活性定義

一個(gè)活性單位（U）指用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在72℃、30 min內(nèi)，攝入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存條件

-20℃保存2年。

問：Pfu DNA聚合酶的保真性為何高于Taq DNA聚合酶？

答：這是由于Pfu DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，可在擴(kuò)增的過程中，切掉錯(cuò)配的堿基，降低堿基錯(cuò)配率。Taq DNA聚合酶的堿基錯(cuò)誤率為1×10-5，而Pfu

DNA聚合酶的堿基錯(cuò)誤率僅為1×10-6。Pfu DNA聚合酶主要用于基因篩選、克隆表達(dá)、突變檢測、定點(diǎn)突變等對(duì)保真性有很高要求的實(shí)驗(yàn)。其擴(kuò)增產(chǎn)物只具有

平末端，可直接用于平末端連接。要提高TA克隆效率，建議對(duì)PCR產(chǎn)物純化后，加A再進(jìn)行TA克隆，加A方法見**頁。

問：Pfu DNA聚合酶能擴(kuò)增多大的片段？

答：對(duì)于簡單模板，可以擴(kuò)增2 kb以下的片段。擴(kuò)增長片段時(shí)，能否擴(kuò)增成功主要與模板與引物的設(shè)計(jì)有關(guān)。為獲得良好的擴(kuò)增結(jié)果，建議引物長度大于18 bp，

Tm在55-80℃之間，濃度在0.1-0.5μM之間，略高于Taq。如需要很高的保真性，且又?jǐn)U增較長片段時(shí)，建議選擇Fusion pfu DNA聚合酶。

問：Pfu DNA聚合酶的擴(kuò)增效率為何低于Taq DNA聚合酶？

答：這可能決定于Pfu DNA聚合酶本身的結(jié)構(gòu)與特性。且具有核酸外切酶的活性，容易降解PCR引物。建議在配制PCR反應(yīng)時(shí)，最后加入Pfu DNA聚合酶或使用

PfuMix。

問：使用Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增時(shí)，有沒有必要在冰上配制PCR反應(yīng)液？

答：有必要。建議在冰上配制PCR 反應(yīng)液后，再放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。這有利于提高擴(kuò)增的特異性，減少非特異性條帶背景，獲得良好的PCR結(jié)果。