Cat. #:P8021,P8022
產品簡介
本試劑盒是按照教學實驗內容設計的,符合標準擴增流程的,教學用PCR反應試劑盒。本試劑盒所提供的模板為插入特定大小DNA片段的PBluescipt SK(+)重組質粒;引物為根據所插入DNA序列和擴增片段大小不同設計的上下游引物。PCR結果可獲得特定大小(500 bp或1,000 bp)的PCR產物。
產品組成
Component | P8021 (500 bp,30次) | P8022 (1,000 bp,30次) |
DNA模板 | 150 μl,500 bp | 150 μl,1,000 bp |
上游引物 (10 μM) | 75 μl | 75 μl |
下游引物(10 μM) | 75 μl | 75 μl |
dNTP混合物(2.5 mM) | 150 μl | 150 μl |
Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl) | 40 μl | 40 μl |
10×PCR緩沖液 | 500 μl | 500 μl |
超純水 | 1 ml | 1 ml |
說明書 | 1份 | 1份 |
活性定義
一個活性單位(U)指用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物,在72℃、30 min內,攝入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
保存條件
10×PCR緩沖液保存于4℃,其他成分-20℃保存。
質量控制
純度檢測:經質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能檢測:PCR方法檢測本試劑盒無宿主殘余DNA,也無其他DNA污染,能有效完成PCR擴增。
應用舉例
1. 配制反應體系
請于冰上配置反應體系,體系大小與組分用量與添加順序可調整:
Ordinal | Component | Volume (25 μl reaction volume) | Volume (50 μl reaction volume) | Volume (50 μl reaction volume,n管) |
1 | 10×PCR緩沖液(Mg2+ Plus) | 2.5 μl | 5 μl | 5×(n+1) μl |
2 | dNTPs(2.5mM) | 2 μl | 4 μl | 4×(n+1) μl |
3 | 上游引物 (10 μM) | 1 μl | 2 μl | 2×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
4 | 下游引物 (10 μM) | 1 μl | 2 μl | 2×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
5 | Taq DNA聚合酶(2.5U/μl) | 0.5 μl | 1 μl | 1×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
6 | template DNA | 2 μl | 4 μl | 4×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
7 | 超純水 | 16 μl | 32 μl | 32×(n+1) μl |
8 | 石蠟油 | 如不能設置頂蓋溫度,需適量加入石蠟油。 |
● 加入各組分后,請用槍頭反復吸吹幾次,充分混勻。
● 在一次配制多管需分裝時建議按(n+1)的反應液量配制,以確保分配時的耗損不會影響實驗,同時選擇大于總體積的離心管便于混勻。
● 如需使用其他體積的PCR反應體系,請按各組分比例縮減或增加各組分用量。
● 組分中引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶常用于梯度實驗,如有調整,請注意調超純水的用量至相應的體系。
● 將混勻的各管短暫離心,置于PCR儀中。
2. 設定反應程序進行PCR反應
Stage | Temperature | Time | Number of Cycles |
Initial Denaturation | 94℃ | 3 min | 1 |
Denaturation | 94℃ | 30 sec | 30 |
Annealing | 55℃ | 30 sec | |
Extension | 72℃ | 30 sec or 45 sec | |
Final Extension | 72℃ | 5 min | 1 |
● 設定PCR程序時,請根據目的片段大小決定延伸時間,如果目的片段大小為500 bp時,延伸時間為30 sec,目的片段為1 kb時,延伸時間為45 sec。
3. 分析結果
反應結束后取2-5 μl反應產物與loading buffer混勻后進行瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。
● 500 bp產物建議電泳條件為1.7%瓊脂糖凝膠,0.5×TBE,7 V/cm,20-40 min,建議Marker為 DSTM 2000(M1101)。
● 1 kb產物建議電泳條件為1.0%瓊脂糖凝膠,1×TAE,7 V/cm,20-40 min,建議Marker為 DSTM 5000(M1111)。
注意事項
請嚴格按照說明書提供的實驗體系及實驗條件進行試驗。
室溫下Taq DNA聚合酶有一定的活性,為避免發生非特異性擴增,請于冰上配置反應體系,并且最后添加Taq DNA聚合酶或模板DNA。
挑取菌落時,應選擇單菌落,不要挑取太多菌體,以免影響PCR結果。