Pfu Mix(P2021-P2022)

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Pfu Mix(P2021-P2022)

價格：￥160.00~650.00

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P2021（1 ml（40次，50 μl/次）） P2022（1 ml*5（200次，50 μl/次）

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Pfu Mix

Cat. #：P2021，P2022

產品簡介

Pfu Mix是2×濃縮的PCR擴增預混和溶液，含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、緩沖液等PCR擴增必需組分（模板與引物除外）。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行PCR，大大簡化操作過程，縮短操作時間，降低污染（加樣次數減少）。同時，由于體系內含有優化劑與增強劑，能夠顯著增強PCR擴增的靈敏度。擴增產物具有平末端。

Pfu DNA聚合酶是極端嗜熱性細菌Pyrococcus furiosus來源的高度熱穩定DNA聚合酶，分子量為90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。擴增片段的長度可達5 kb（簡單模板）。延伸速度為2min/kb（70-75℃，簡單模板可達20s/kb）。該酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。

產品組成

Component	P2021	P2022
2× Pfu Mix	1 ml	1 ml× 5
超純水	1 ml	1 ml× 5

本產品分含體系中包含溴酚藍、不含溴酚藍兩類。體系中包含溴酚藍的產品，PCR擴增產物可直接電泳檢測。這兩類產品的擴增性能無差異。如無特別說明提供體系中包含溴酚藍的包裝。

保存條件

-20℃保存2年。

質量控制

純度檢測：經質量檢測，產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測：PCR方法檢測無宿主殘余DNA，能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。

應用舉例

1. 配制反應體系

請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調整：

Ordinal	Component	Volume (50 μl reaction volume)	Final concentration (50 μl reaction volume)
1	2× Pfu Mix	25 μl	1×
2	upstream primer (10 μM)^[1]	2 μl	0.4 μM
3	downstream primer (10 μM)^[1]	2 μl	0.4 μM
4	template DNA^[2]	1-4 μl	<1μg
5	超純水^[3]	To 50 μl	-
optional	MgCl₂(MgSO₄)/PCR Enhancer^[4]	Variable	-

[1] 引物終濃度建議范圍：0.1-1 μM。特異性差時可降低濃度，效率低時可提高濃度。

[2] 不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建議用量如下表（50 μl反應體系）。

Template	人類基因組DNA	λDNA	大腸桿菌基因組DNA	質粒DNA
Dosage	0.1μg-1μg	0.5ng-5ng	10ng-100ng	0.1ng-10ng

[3] 可單獨訂購超純水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。

[4] 可單獨訂購25mM MgCl₂（Cat. #：P9031）和PCR Enhancer（Cat. #：P9041）。

2. 設定反應程序進行PCR反應

Stage	Temperature	Time	Number of Cycles
Initial Denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	30 sec	25-35
Annealing	55-68℃^[1]	30 sec
Extension	72℃	Variable^[2]
Final Extension	72℃	5-10 min	1

[1] 退火溫度應根據Tm值較低的引物來設。

[2] 延伸時間按2min/kb來設最佳（簡單模板可達20s/kb）。

3. 分析結果

反應產物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。如有需要，可進行割膠回收。

無產物或產物量少的改進措施有：1調整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分，需要高倍稀釋（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl₂（Cat. #：P9031）等可提高產量。

操作注意事項

1 室溫下Pfu DNA聚合酶有一定的活性，為避免發生非特異性擴增，請于冰上配置反應體系，并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。

2 Pfu DNA聚合酶的擴增產物只有平末端，可直接用于平末端連接。如要進行TA克隆，請先進行加A反應，以提高克隆效率。（加A反應：參考如下體系，72℃，15-30min）

PCR（純化）產物	1-7 μl
10× Taq Buffer（Mg²⁺ Plus）	1 μl
dATP	0.2 mM
Taq DNA聚合酶	5U
超純水	To 10 μl

3 堿基出錯率是指在每個堿基合成過程中所摻入的錯誤核苷酸數目。Pfu DNA聚合酶的堿基錯誤率為1×10^-6。

4 dUTP、dITP和含有這些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR擴增。因為該酶與含有尿嘧啶和次黃嘌呤的DNA模板結合后會中止DNA聚合反應。

引物設計注意事項

引物長度一般在15-30個堿基之間；上下游引物3’末端避免互補，避免出現3個以上重復的G或C，或出現發夾結構，否則會產生非特異性擴增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量盡量接近；Tm值控制在55-65℃之間，且上下游引物Tm值盡量接近，額外附加序列（酶切位點、修飾等）是非模板匹配序列，不參與Tm值計算。

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名稱	貨號	規格
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