Gold逆轉錄酶
Gold逆轉錄酶
貨號/規格：R3001/2,000U, R3002/10,000U
產品簡介
Gold逆轉錄酶是通過基因重組技術改造M-MLV得到的耐熱逆轉錄酶，具有更高的熱穩定性，可在 37℃-55℃條件下合成第一鏈cDNA。同時該酶去除了RNaseH 活性，對于常見的逆轉錄反應抑制劑具有較高的耐受度，cDNA合成能力更強，可用于復雜二級結構的RNA逆轉錄，能夠合成較長的cDNA 以及構建高比例的全長cDNA文庫等。
產品組成
Component | R3001 (2,000U) | R3002 (10,000U) |
Gold逆轉錄酶（200U/μl） | 10 μl | 50 μl |
5X Gold Buffer | 100 μl | 500 μl |
活性定義
以Poly (rA)·Oligo (dT)為模板/引物，在37℃，10 min條件下，使1 nmol的dTTP摻入酸性沉淀物質所需要的酶量定義為1個活性單位(U)。
保存條件
-30~-15℃保存。
應用舉例
第一鏈cDNA合成
1. 配制反應體系
按以下體系于RNase-free的離心管中配制逆轉錄反應液：
Component | Amount | Final Conc. |
Oligo (dT)15 Primer (50 μM) [1] or Random Primer (100 μM) [1] or 特異性引物 (2 μM) [1] | 1 μl | 2.5 μM |
5 μM | ||
0.1 μM | ||
Total RNA [2] or Poly A+ RNA [2] | 10 pg ~ 1 μg 10 pg ~ 100 ng | 0.5 pg ~ 50 ng/μl |
0.5 pg ~ 5 ng/μl | ||
5X Gold Buffer | 4 μl | 1X |
dNTP Mix (10 mM each) | 1 μl | 0.5 mM |
Gold 逆轉錄酶 (200 U/μl) | 1 μl | 10 U/μl |
RNase inhibitor (40 U/μl) | 1 μl | 2 U/μl |
RNase-free ddH2O | to 20 μl | - |
[1] 請根據實驗需要選擇合適的引物：Oligo dT引物僅轉錄mRNA，Random Primer可轉錄所有類型的RNA，特異性引物僅轉錄特異的RNA片段。當后續實驗為qPCR時，建議混合使用Oligo dT和Random Primer各1 μl，提高定量結果的準確性。
[2] 若產物后續進行PCR反應，則建議先對模板RNA進行變性處理打開二級結構，有助于提高逆轉錄產物的產量。配置以下反應體系，于65℃加熱5 min，再置于冰上迅速冷卻2 min：
Component | Amount |
Total RNA or Poly A+ RNA | 10 pg ~ 5 μg 10 pg ~ 500 ng |
RNase-free ddH2O | to 10 μl |
2. 設定程序進行逆轉錄反應
將上述混合物充分混勻后按以下條件進行逆轉錄反應：
Temperature | 后續為PCR反應 | 后續為qPCR反應 |
Time | ||
25℃ [1] | 5 min | / |
37℃ [2] | 45 min | 15 min |
85℃ | 5 sec | 5 sec |
[1] 僅當使用Random Primer時需要此步，當使用Oligo (dT)15 Primer或特異性引物時無需進行此步。
[2] 當模板RNA具有復雜的二級結構或者高GC含量時，可將溫度提高至50℃。
產物可立即進行PCR、qPCR反應，或保存于-20℃及以下環境中，并避免反復凍融。
注意事項
1. 請使用高質量的RNA，保證逆轉錄反應的效率
2. 在逆轉錄反應中注意防止RNase污染
本品僅供科學研究使用。
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