FS? Mix Direct for Blood
Cat. #:P2071a,P2072a
產(chǎn)品簡介
FS? Mix Direct for Blood是適合全血模板擴增的2×濃縮快速高效PCR預(yù)混合溶液,含有FS? Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、緩沖液等PCR擴增必需組分(模板與引物除外)。使用時,僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行PCR,從而可以極大地簡化操作過程,縮短操作時間,降低污染(加樣次數(shù)減少)。FS? Mix Direct for Blood的反應(yīng)體系經(jīng)過優(yōu)化處理,高靈敏度的FS? Taq DNA聚合酶確保處理液中的微量樣本得到高效擴增。本產(chǎn)品不用進行繁瑣的DNA提取,最大限度減少實驗誤差和交叉污染;同時依靠特殊的緩沖體系增強PCR擴增的特異性,保證擴增效果與DNA模板擴增效果同樣可靠。
FS? Taq DNA聚合酶是根據(jù)蛋白工程原理,以Taq DNA聚合酶為基礎(chǔ),研發(fā)設(shè)計的新一代DNA聚合酶。本產(chǎn)品具有類似KOD酶的快速擴增能力,延伸速度為20s/kb(70~75℃,簡單模板可達5s/kb)。是普通Taq DNA聚合酶的3倍,可縮短一半以上的擴增時間;同時具備Taq DNA聚合酶擴增效率高、適應(yīng)性廣等優(yōu)點。FS? Taq DNA聚合酶使用方法與普通Taq DNA聚合酶基本相同,只需注意適當(dāng)縮短延伸時間。該酶具有5'→3'聚合酶活性,無3'→5'外切酶活性。擴增產(chǎn)物具有3'-dA突出端,可直接用于TA克隆。
產(chǎn)品組成
Component | P2071a | P2072a |
2× FS? Mix Direct for Blood | 1 ml | 1 ml× 5 |
超純水 | 1 ml | 1 ml× 5 |
本產(chǎn)品分體系中包含溴酚藍(lán)、不含溴酚藍(lán)兩類。體系中包含溴酚藍(lán)的產(chǎn)品,PCR擴增產(chǎn)物可直接電泳檢測。這兩類產(chǎn)品的擴增性能無差異。如無特別說明提供體系中包含溴酚藍(lán)的包裝。
保存條件
-20℃保存2年。
質(zhì)量控制
純度檢測:經(jīng)質(zhì)量檢測,產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能檢測:PCR方法檢測無宿主殘余DNA,能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。
應(yīng)用舉例
1. 配制反應(yīng)體系
請于冰上配置反應(yīng)體系,體系大小與組分用量與添加順序可調(diào)整:
Ordinal | Component | Volume (50 μl reaction volume) | Final concentration (50 μl reaction volume) |
1 | 2× FS? Mix Direct for Blood | 25 μl | 1× |
2 | upstream primer (10 μM)[1] | 2 μl | 0.4 μM |
3 | downstream primer (10 μM)[1] | 2 μl | 0.4 μM |
4 | 全血 | 0.5 μl | <1μg |
5 | 超純水[2] | To 25 μl | - |
optional | MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[3] | Variable | - |
[1] 引物終濃度建議范圍:0.1-1 μM。特異性差時可降低濃度,效率低時可提高濃度。
[2] 可單獨訂購超純水(Cat. #:P9021/P9022/P9023)。
[3] 可單獨訂購25mM MgCl2(Cat. #:P9031)和PCR Enhancer(Cat. #:P9041)。
2. 設(shè)定反應(yīng)程序進行PCR反應(yīng)
大多數(shù)模板的快速擴增條件:
Stage | Temperature | Time | Number of Cycles |
Initial Denaturation | 94℃ | 4 min | 1 |
Denaturation | 94℃ | 30 sec | 28-40 |
Annealing | 55-68℃[1] | 30 sec | |
Extension | 72℃ | Variable[2] | |
Final Extension | 72℃ | 2 min | 1 |
[1] 退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值較低的引物來設(shè)。
[2] 延伸時間按20 sec/kb來設(shè)最佳。
1kb簡單模板的快速擴增條件:
Stage | Temperature | Time | Number of Cycles |
Initial Denaturation | 95℃ | 3 min | 1 |
Denaturation | 95℃ | 15 sec | 28-40 |
Annealing | 55-68℃ | 15 sec | |
Extension | 72℃ | 20 sec | |
Final Extension | 72℃ | 2 min | 1 |
由于1kb簡單模板的二級結(jié)構(gòu)簡單,且長度較短,可同時縮短變性、退火時間至15s,以實現(xiàn)快速擴增。
3. 分析結(jié)果
反應(yīng)產(chǎn)物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像設(shè)備觀察目的條帶的擴增情況。如有需要,可進行割膠回收。無產(chǎn)物或產(chǎn)物量少的改進措施有:1調(diào)整退火溫度;2減少抑制劑的影響,如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分,需要高倍稀釋(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脫,提高模板DNA的純度;4使用PCR添加劑,如PCR Enhancer(Cat. #:P9041)、MgCl2(Cat. #:P9031)等可提高產(chǎn)量。
操作注意事項
室溫下FS? Taq DNA聚合酶有一定的活性,為避免發(fā)生非特異性擴增,請于冰上配置反應(yīng)體系,并且最后添加模板DNA。
本產(chǎn)品可直接從新鮮或凍存的全血、抗凝全血(EDTA或其他抗凝劑)、FTA卡等樣本擴增DNA。可用于人血或其他動物血液。
延伸時間視片段長度而定。一般情況,≤500bp目的片段延伸15s,500bp-1kb延伸20s,>1kb延伸時間按20s/kb計算。
FS? Taq DNA聚合酶具有脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性,因此在PCR產(chǎn)物3’末端通常會加上一個多余的脫氧腺嘌呤核苷,可進行TA克隆。
FS? Mix Direct for Blood也可采用常規(guī)程序擴增,擴增產(chǎn)物純化后可直接用于測序反應(yīng)。
為方便加樣,全血可用PBS稀釋后加樣,模板用量根據(jù)樣本、實驗要求而定。
引物設(shè)計注意事項
引物長度一般在15-30個堿基之間;上下游引物3’末端避免互補,避免出現(xiàn)3個以上重復(fù)的G或C,或出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu),否則會產(chǎn)生非特異性擴增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量盡量接近;Tm值控制在55-65℃之間,且上下游引物Tm值盡量接近,額外附加序列(酶切位點、修飾等)是非模板匹配序列,不參與Tm值計算。
相關(guān)產(chǎn)品
名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
PCR Mix | P2011/P2012/P2013/P2014/P2015 | 1ml/5ml/10ml/50ml/100ml |
Power Green qPCR Mix | P2101/P2102/P2103/P2104/P2105 | 1ml/5ml/10ml/50ml/100ml |
1kb ladder | M1181/M1182 | 50次/250次 |
DSTM5000 | M1111/M1112 | 60次/300次 |
高純度質(zhì)粒小提試劑盒 | N1011/N1012/N1013 | 50次/100次/200次 |
通用RNA提取試劑盒 | R1051 | 50次 |
基因組DNA快速提取試劑盒 | N1111/N1112 | 50次/100次 |
DNA凝膠回收試劑盒 | N1071/N1072/N1073 | 50次/100次/200次 |
RT-PCR Kit | R1011/R1012 | 20次/100次 |
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