1、從柱離心式產品的流行看經典方法的缺點 （或者操作重點）

柱式方法的風行是無法否定的現實。下面通過柱式方法與經典方法的比較，看一看如何注意經典方法的操作重點。

裂解，二者幾乎沒有任何區別。去蛋白質，柱式靠的是柱材料對蛋白質吸附力低這一特點，將蛋白質殘留控制在比較低的水平 (并不是/也不能徹底去除)；經典方法最常用的是 PC 抽提，可以將蛋白質去除得更徹底一些。其它大分子雜質 - 如多糖等 - 的去除，柱式的與蛋白質的去除相似，但經典方法中卻沒有如此方便的對應方法。小分子物 (鹽等) 的去除，是柱式方法最優勢所在。如果柱子設計沒有問題，離心后柱子中殘留的液體穩定而少；柱式的洗滌具有“流水洗滌”的效果；柱式中的核酸是不成團塊的 - 這三個特點決定了柱式的洗滌效率比經典的洗滌效率高，所以，柱式純化的核酸純度比較高。

2、  應該使用多少菌液？

根據我們的經驗，如為高拷貝質粒（如：pUC118等），使用2 ml培養液與4 ml培養液純化的質粒DNA的收量差別不是很大，可以純化到20-25 μg的高純度質粒DNA。如提取地拷貝質粒或大于10 kb質粒，建議使用5-10 ml的菌液（可分幾管收集菌體，按比例加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，再將離心上清分批轉移至DNA純化柱），吸附和洗脫的時間可以適當延長，洗脫時使用的溶液Eluent應在60℃水浴預熱。高純度質粒小提試劑盒所配硅膠柱的最大吸附量是40 μg，滿足絕大多數實驗所需用量。

3、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的用量問題

溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的比例是固定的，如果增加或減少用量都請按比例變化，但是一般來說，用量原則是確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中（具體表現是加入溶液Ⅱ后，能形成澄清的裂解溶液）。濃度過低，將導致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質的過程復雜且不徹底，導致純度下降。溶液的用量是以樣品中蛋白質的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準。

4、 溶液Ⅱ操作時要注意的事項

在反應液充分的時候，第一，反應的時間不能過長，長時間的堿性條件會打斷DNA，基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被溶液Ⅲ沉淀了；第二，不得激烈振蕩，不然基因組DNA也會斷裂最后得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。

5、質粒質量檢測

將抽提好的核酸直接用于后續的實驗，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，該方法還是非常可信的；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準確度與經驗有關；另外，電泳也可能提供某些雜質污染的信息，但是同樣與經驗有關。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結果并不十分可信。一般講，同時進行紫外和電泳檢測，綜合二者的結果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現壞的結果能用于后續實驗而好的結果卻不能用于后續實驗，也不用大驚小怪。

6、 質粒電泳條帶

瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時，多數情況下你能看到三條帶，但不要認為你看到的是超螺旋、線性和開環這三條帶。堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，用EcoRI來線性化質粒后再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時候抽提到的質粒會有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數不同）所致。

7、 核酸的保存

純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險；如果操作過程控制得當，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。基本上，核酸在保存中的穩定性，與溫度成反比，與濃度成正比。

如果溫度合適，保存中核酸發生降解或者消失，首要原因是酶殘留導致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導致的水解 (RNA 在弱酸性更穩定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的，就是 EP 管對核酸的影響。首先一定要堅信一點，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發生反應，達到某種均衡。EP 管的材質，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導核酸的結構發生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現象可能觀察不到；當核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩定核酸，雖然已經為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當回事。現在制造 EP 管的材料遠多于過去。這些新出現的材料，在強度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP 材質要好許多，但其化學特征，尤其是對核酸穩定性的可能影響，遠沒有研究透徹。正如現在的質粒可以改造得越來越適用某些要求一樣，其負面產物可能是，抽提的質粒電泳的構型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。

8、 核酸抽提中的溫度問題

核酸抽提中的溫度問題，也是一個值得關注的問題。首先要明確的一點是，任何一個溫度條件，對某些方面有利，同時也一定會有不利的一面。如沉淀，低溫操作會提高得率，但也會增加雜質的殘留。任何一步操作該用什么溫度為好，應該是利弊權衡的結果。基本上，除了一些特殊的步驟，如消化等外，用室溫是最好的選擇。低溫的確可以減低酶的活性，但低溫同時也降低了這些酶被裂解液中的試劑滅活或者抑制的速度，此消彼長，沒有辦法給出結論的。